Terminální deoxynukleotidyltransferáza (TdT)

Popis

Terminální deoxynukleotidyltransferáza (TdT) je speciální DNA polymeráza nezávislá na templátu, která katalyzuje přidávání nukleotidů na 3' konec jednovláknové nebo dvouvláknové DNA. Jako substrát může sloužit dvouvláknová DNA s tupými i lepivými konci nebo jednovláknová DNA. Tento enzym s molekulovou hmotností 58 kD nemá 5' ani 3' exonukleézovou aktivitu. Aktivita je stimulována 1 mM Co2+.

Aplikace

Přidání homopolymerů na 3' konce DNA

Značení 3' konců DNA modifikovanými nukleotidy (např. DdNTP, DIG-dUTP)

Metoda TUNEL (in situ lokalizace apoptózy)

PCR závislá na TdT

Zdroj
Kmen E. coli, který nese klonovaný gen terminální transferázy z telecího brzlíku.

Čistota
více než 99 % (stanoveno metodou SDS-PAGE)

Definice jednotky
Jedna jednotka je definována jako množství enzymu katalyzujícího inkorporaci 1 nmol dTTP do materiálu nerozpustného v kyselině v celkovém reakčním objemu 50 ul za 1 hodinu při 37 ° C za použití d(A)18 jako primeru.

Specifická aktivita
42 000 jednotek/mg

5 ' - 3' exonukleáza
Ne

3 ' - 5' exonukleáza
Ne

Doporučené podmínky skladování
-20 °C

Skladovací pufr
100 mM octan draselný (pH 6.8), 2 mM 2-merkaptoethanol, 0.01% (v/v) Triton X-100, 50% (obj./obj.) Glycerolu

10x reakční pufr
500 mM octan draselný, 200 mM Tris-acetát, 100 mM octan hořečnatý (pH 7.9 při 25 °C), 25 mM CoCl2 (pH 7.2 při 25 °C)

Inhibice a deaktivace

Inhibitory: kovové chelátory, amonium, chlorid, jodid, fosfátové ionty, heparin, chemicky modifikovaná DNA.
Inaktivuje se zahříváním na 70 °C po dobu 10 minut nebo přidáním EDTA.

Poznámka

Vzhledem k přítomnosti CoCl2 je reakční pufr TdT nekompatibilní s navazujícími aplikacemi. CoCl2 je nutné z reakční směsi odstranit centrifugací nebo extrakcí fenol/chloroformem a následným srážením ethanolem.