CviJI*

Zdroj: Chlorella virusIL-3A

5’-G C-3’
3’-C G-5’

kromě

5’-Py G C Pu-3’
3’-Pu C G Py-5’

Poznámka: Izolováno z rekombinantního zdroje (patent č. US005472872A)

Reakční teplota: 37 °C

Prototyp: CviJI*

Inaktivační teplota (20 min): 50 °C

Reakční pufr:

1x CviJI* buffer: 20 mM glycylglycin-KOH (pH 8.5), 10 mM octan hořečnatý, 50 mM octan draselný, 0.1 mM ATP, 0.1 mM dithiothreitol, 30 % DMSO (reakční pufr je poskytnut jako 2x koncentrovaný zásobní roztok).

Definice jednotky: Jedna jednotka je množství enzymu potřebné k úplnému rozštěpení 1 µg pBR322 DNA za 1 hodinu. Celkový reakční objem je 25 ul.

Podmínky skladování: Skladujte při –20 °C.

Popis:

CviJI* je unikátní restrikční enzym schopný štěpit DNA na dvou nebo tříbázové rozpoznávací sekvenci (1,2).

CviJI (kat. č. 2125) normálně štěpí sekvenci 5′-PuGCPy-3′ mezi G a C za vzniku fragmentů s tupými konci. Za „relaxačních“ podmínek (v přítomnosti Mg2+, ATP a enhancerů) CviJI* štěpí sekvence 5′-G C-3′ kromě 5′-PyG CPu-3′. Je schopný štěpit jednovláknovou DNA a dvouvláknovou DNA na malé fragmenty 20-200 bp. Z neznámých vzorků DNA generuje četné sekvenčně specifické oligonukleotidy.

Aplikace:

CviJI a CviJI* štěpí DNA extrémně často, a proto mohou být použity pro řadu nových aplikací molekulární biologie (2,3,4). Štěpení anonymní DNA enzymem CviJI po tepelné denaturaci produkuje velké množství polymerů o velikosti oligonukleotidů, které lze využít v aplikacích, jako jsou 1. projekty mapování nebo sekvenování ve velkém měřítku využívající anonymní primery; 2. mapování krátkých DNA s vysokým rozlišením; 3. značení nukleové kyseliny (Thermal Cycle Labeling, 4, obr. 1), 4. detekce (5); 5. amplifikace (5); 6. klonování (2, 3) a 7. zachycení nukleových kyselin. Částečné štěpení CviJI/CviJI* lze také použít v aplikacích, jako je shot-gun klonování, generování quasi-random knihoven(2) a mapování epitopů.

Poznámka:

(1) CviJI* restrikční endonukleáza je inhibována koncentracemi glycerolu vyššími než 2,5 %. Proto se doporučuje spíše prodloužit dobu štěpení než přidat další jednotky CviJI*. Alternativně lze vzorek DNA vysrážet ethanolem a znovu štěpit.

(2) Kvůli extrémní frekvenci rozpoznávacích míst CviJI*/CviJI je blízko nich pozorována sterická interference, což má za následek pomalejší štěpení. V důsledku toho jsou generované oligonukleotidové fragmenty zřídka kratší než 15 bp, což je činí ideálními pro aplikaci jako anonymní primery.

(3) CviJI* reakční pufr obsahuje DMSO, který neinterferuje s dalšími enzymatickými reakcemi (ligace, značení atd.). Pokud je vzorek určen pro elektroforézu, po dokončení štěpení se důrazně doporučuje vysrážení reakční směsi ethanolem, aby se zabránilo tvorbě difúzních pásů na agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu.

Kontrola kvality:

Nespecifická endonukleáza: Inkubace 1 jednotky CviJI* s 1 µg plazmidové DNA pBR322 při 37 °C po dobu 16 hodin (16násobné nadměrné štěpení) vedla ke stejně ostrému charakteristickému vzoru pruhů jako standardní testovací reakce (stanoveno elektroforézou na agarózovém gelu).

3'-Exonukleáza: 0.3, 0.6 a 1.2 jednotky CviJI* a 0.13 µg (0.65 pmol 3'-konců) fragmentů lambda/TaqI (3′-značených T4 DNA polymerázou a [3H]dGTP a [³H]dGTP a [³H]dGTP inkubace po dobu 1 hodiny při 37 °C vedla k 0.03 sklonu %-end značky uvolněné na jednotku enzymu. Reakční objem 10 µl.

5'-Exonukleáza/5'-fosfatáza: Inkubace 5, 10 a 20 jednotek CviJI* s 0.05 µg (0,30 pmol 5'-konců) fragmentů [5'-33P] lambda/HaeIII při 3 °C 1 hodinu vedla ke 0.024 sklonu %-end značky uvolněné na jednotku enzymu. Reakční objem 10 µl.

Reference:

1. Xia, Y., Burbank, D., Uher, L., Rabussay, D. and Van Etten, J. Nucleic Acids Res.15, 6075-6090.
2. Fitzgerald,M.C., Skowron, P., Van Etten, J.L., Smith, L.M. and Mead, D.A. (1992) Nucleic Acids Res. 20,3753-3762.
3. Skowron, P.M, Swaminathan, N., McMaster, K., George, D., Van Etten, J. andMead, D. Gene 157 (1995) 37-41.
4. Mead, D., Swaminathan, N., Van Etten J. and Skowron, P.M.: Recombinant CviJI restriction endonuclease. (1995) Unites States Patent no US005472872A.
5. Swaminathan, N., McMaster, K., Skowron, P. and Mead, D.A. Analytical Biochemistry 255 (1998) 133-141.