CviJI

Zdroj: Chlorella virusIL-3A

5’-Pu G C Py-3’
3’-Py C G Pu-5’

Poznámka: Izolováno z rekombinantního zdroje (patent č. US005472872A)

Reakční teplota: 37 °C

Prototyp: CviJI

Inaktivační teplota (20 min): 50 °C

Reakční pufr:

1x CviJI buffer: 20 mM glycylglycin-KOH (pH 8.5), 10 mM octan hořečnatý, 50 mM octan draselný, 0.1 mM dithiothreitol, 10 % DMSO (reakční pufr je poskytnut jako 5x koncentrovaný zásobní roztok).

Definice jednotky: Jedna jednotka je množství enzymu potřebné k úplnému rozštěpení 1 µg pBR322 DNA za 1 hodinu. Celkový reakční objem je 25 ul.

Podmínky skladování: Skladujte při –20 °C.

Popis:

CviJI je jediný restrikční enzym schopný štěpit DNA na dvou nebo tříbázové rozpoznávací sekvenci (1,2, 3).

CviJI štěpí jen sekvenci 5′-PuGCPy-3′. Nemá hvězdičkovou aktivitu (1,2), proto je vhodný při mapování krátkých DNA fragmentů jako jsou amplikony a plasmidy. K dalším aplikacím jako je shotgun klonování, thermal cycle labeling (5) nebo epitopové mapování může být využit CviJI tak i CviJI*.

Kontrola kvality:

Nespecifická endonukleáza: Inkubace 1 jednotky CviJI s 1 µg plazmidové DNA pBR322 při 37 °C po dobu 16 hodin (160násobné nadměrné štěpení) vedla ke stejně ostrému charakteristickému vzoru pruhů jako standardní testovací reakce (stanoveno elektroforézou na agarózovém gelu).

3'-Exonukleáza: 0.3, 0.6 a 1.2 jednotky CviJI a 0.13 µg (0.65 pmol 3'-konců) fragmentů lambda/TaqI (3′-značených T4 DNA polymerázou a [3H]dGTP a [³H]dGTP a [³H]dGTP inkubace po dobu 1 hodiny při 37 °C vedla k 0.03 sklonu %-end značky uvolněné na jednotku enzymu. Reakční objem 10 µl.

5'-Exonukleáza/5'-fosfatáza: Inkubace 5, 10 a 20 jednotek CviJI s 0.05 µg (0,30 pmol 5'-konců) fragmentů [5'-33P] lambda/HaeIII při 37 °C 1 hodinu vedla ke 0.024 sklonu %-end značky uvolněné na jednotku enzymu. Reakční objem 10 µl.

Reference:

1. Xia,Y., Burbank, D., Uher, L., Rabussay, D. and Van Etten, J. Nucleic Acids Res.15, 6075-6090.
2. Fitzgerald,M.C., Skowron, P., Van Etten, J.L., Smith, L.M. and Mead, D.A. (1992) Nucleic Acids Res. 20, 3753-3762.
3. Mead, D., Swaminathan, N., Van Etten J. and Skowron, P.M.: Recombinant CviJI restriction endonuclease. (1995) Unites States Patent no US005472872A.
4. Skowron, P.M, Swaminathan, N., McMaster, K., George, D., Van Etten, J. and Mead, D. Gene 157 (1995) 37-41.
5. Swaminathan, N., McMaster, K., Skowron, P. and Mead, D.A. Analytical Biochemistry 255 (1998) 133-141.