RCA DNA Amplification Kit

Kit do amplifikacji DNA RCA to nowatorski produkt opracowany specjalnie do przygotowywania matryc do sekwencjonowania DNA. Jak przedstawiono na Rysunku 1, metoda RCA wykorzystuje polimerazę DNA bakteriofaga phi29 do eksponencjalnej amplifikacji jedno- lub dwuniciowych krążkowych matryc DNA poprzez amplifikację koła obrotowego (RCA) (1, 2). Ta izotermalna metoda amplifikacji umożliwia uzyskanie mikrogramowych ilości DNA z pikogramowych ilości materiału wyjściowego w ciągu kilku godzin.

Amplifikacja in vitro bardzo małych ilości matrycy DNA eliminuje konieczność nocnej hodowli komórkowej i konwencjonalnej puryfikacji plazmidu lub DNA M13. Aktywność korekcyjna polimerazy DNA phi29 zapewnia replikację DNA o wysokiej dokładności (3).

Materiałem wyjściowym do amplifikacji może być niewielka ilość komórek bakteryjnych zawierających plazmid, izolowany plazmid, nietknięty bakteriofag M13 lub dowolny okrężny próbka DNA. Kolonie bakteryjne można zbierać z płyt agarowych i dodawać bezpośrednio do reakcji RCA. Alternatywnie, mikrolitrowe ilości nasyconej kultury bakteryjnej lub zasobu glicerolowego mogą służyć jako materiał wyjściowy. W zależności od źródła materiału wyjściowego, amplifikacja jest ukończona w czasie od 4 do 18 godzin w temperaturze 30°C, bez konieczności cyklowania termicznego. Produkt reakcji RCA to wysokocząsteczkowe, dwuniciowe konkatenemery okrężnej matrycy.

Zauważ, że w przypadku korzystania z klonów M13, produkt RCA to dwuniciowe DNA i można go sekwencjonować za pomocą starterów do sekwencji zarówno w kierunku do przodu, jak i do tyłu. DNA amplifikowane metodą RCA może być używane bezpośrednio w reakcjach sekwencjonowania cyklicznego bez konieczności jakiejkolwiek puryfikacji.

Rysunek 1, Schematyczny diagram procesu RCA. Losowe heksamery przyłączają się do okrężnej matrycy DNA w wielu miejscach. Polimeraza DNA phi29 przedłuża każdy z tych primerów. Gdy polimeraza DNA dociera do primeru przedłużonego w dół strumienia, zachodzi synteza z przemieszczaniem nici. Wypchnięta nić staje się jednoniciowa i gotowa do przyłączenia kolejnego heksamerycznego primeru. Proces ten kontynuuje się, prowadząc do eksponencjalnej, izotermalnej amplifikacji.


Figure 2.
 

Kit do Amplifikacji DNA RCA (100 reakcji) Nr kat.: PPK-100

1. Polimeraza DNA Phi29, 20 µl, (10 000 jednostek/ml)
2. Mieszanka MCRCA 2x, 1 ml
3. Bufor do lizy komórkowej, 1 ml

Kit do Amplifikacji DNA RCA (500 reakcji) Nr kat.: PPK-200

1. Polimeraza DNA Phi29, 100 µl, (10 000 jednostek/ml)
2. Mieszanka MCRCA 2x, 5 ml
3. Bufor do lizy komórkowej, 5 ml

Referencje:

1. Dean, F. et al., Genome Research 11, 1095–1099 (2001).
2. Lizardi, P. et al., Nat. Genet. 19, 225–232 (1998).
3. Estaban, J. A. et al., J. Biol. Chem. 268, 2719–2726 (1993).