QuantumScript™ HD Reverse Transcriptase

Opis:

QuantumScript™ HD Reverse Transcriptase to zmutowana wersja o zwiększonej wrażliwości, poprawionej specyficzności i maksymalnej termostabilności. QuantumScript™ HD Reverse Transcriptase została zaprojektowana tak, aby miała dłuższy okres półtrwania przy 50°C, co umożliwia przetwarzanie dłuższych RNA o bardziej skomplikowanej strukturze drugorzędowej. Zwiększoną termostabilność enzymu uzyskuje się poprzez ponowne zbudowanie domeny polimerazy DNA opartej na RNA i połączenie nowej domeny powierzchniowej oddziałującej z RNA w miejscu domeny RNazy H. Enzym jest oczyszczany do jednorodności, aby zapewnić wysoką termostabilność, specyficzność, dokładność, wydajność i syntezę cDNA pełnej długości w większym stopniu niż oferuje to wysokiej jakości odwrotna transkryptaza. Optymalna temperatura syntezy pierwszego łańcucha cDNA dla tego enzymu wynosi 50°C, a zakres pracy obejmuje temperatury od 37°C do 55°C, z produktem cDNA o długości od 100 pb do 12 Kb.

Numer katalogowy: SSIII-100, SSIII-200 i SSIII-300

Źródło: E.coli

Stężenie: 200 jednostek/μl Bufor przechowywania: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM DTT, 0.05% Triton X-100 (v/v), 0.1 mM EDTA, 0.1 M NaCl i 50% glicerolu (v/v). Bufor reakcji (5x): 250 mM Tris-HCl (pH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2 i 50 mM DTT

Definicja jednostki: Jedna jednostka enzymu wbudowuje 1 nmol dTTP w materiał kwasowy w 10 minut przy 37°C, używając poli(A):oligo(dT)25 jako matrycy-i startera. Kontrola jakości: Ten enzym przeszedł testy kontroli jakości: analiza SDS-PAGE w zakresie czystości, funkcjonalne brak aktywności endonukleazy, funkcjonalne brak aktywności egzonukleazy, funkcjonalne brak aktywności proteazy.

Przechowywanie: -20°C

Protokół

Synteza pierwszego łańcucha cDNA

Materiały dostarczane przez użytkownika:

Inhibitor RNAzy (Cat.# RNIN-100, RNIN-200, RNIN-300) dNTP, 10 mM (Cat.# dNTP-10M, dNTP-25M) Woda wolna od nukleazy

Poniższa procedura wykorzystuje od 10 pg do 5 µg RNA ogólnego lub od 10 pg do 500 ng mRNA.

W sterylnej mikrocentryfugowej probówce RNazowej dodaj startery (200-500 ng oligo(dT)12-18, 50-250 ng starterów losowych lub 2 pmol starterów specyficznych). Podgrzej probówkę do 70°C przez 5 minut i inkubuj na lodzie przez 1 minutę, aby denaturować wszelkie możliwe struktury wtórne w obrębie matrycy. Krótko obróć, aby zbierać roztwór na dnie probówki. Dodaj do scharakteryzowanego startera/matrycy w kolejności pokazanej poniżej. Uwaga: Nie zmieniaj proporcji startera do mRNA. 5 µl 5X buforu reakcji; 5 µl 10mM mieszanki dNTP (10mM każdego dATP, dGTP, dCTP i dTTP) 25 jednostek inhibitora RNAzy 0,5 µl QuantumScript Reverse Transcriptase (200 jednostek/μl) Dodaj wodę nukleazową do końcowego objętości 25 µl Delikatnie wymieszaj. Dla starterów losowych inkubuj probówkę w 25°C przez 5 minut. Przeprowadź syntezę pierwszego łańcucha przy 55°C przez 30-60 minut. Temperatura reakcji może być zoptymalizowana między 50°C a 60°C dla trudnych matryc o wysokiej strukturze wtórnej. Zdezaktywuj enzym, inkubując go w 70°C przez 15 minut. Przed wykonaniem amplifikacji PCR po kroku 4, zaleca się usunięcie RNA przed amplifikacją PCR, aby zapewnić uzyskanie produktu PCR. Dodanie 2 jednostek RNazy H (Cat. # RNHE-100, RNHE-200, RNHE-300) i inkubacja przez 20 minut w 37°C jest zalecane do usunięcia RNA. Standardowe protokoły dla syntezy drugiego łańcucha można znaleźć w literaturze [2]. Uwaga: 5X bufor reakcji jest kompatybilny z enzymami używanymi w licznych technikach analizy DNA. Typowo nie ma potrzeby ekstrakcji fenolowej ani osadzania etanolu z użyciem tego protokołu przed jakąkolwiek amplifikacją PCR.