Pfu DNA Polimeraza

Pfu DNA Polimeraza jest wysoce termostabilną DNA polimerazą uzyskaną z hipotermofilnej archaeum Pyrococcus furiosus. Enzym katalizuje zależną od matrycy polimeryzację nukleotydów w dsDNA w kierunku 5'->3'. Pfu DNA Polimeraza również wykazuje aktywność egzonukleazy 3'->5', co umożliwia polimerazie skorygowanie błędów wbudowywania nukleotydów (ang. proofreading). Nie wykazuje aktywności egzonukleazy 5'->3' . Główna różnica pomiędzy Pfu a alternatywnymi enzymami polega na doskonałej stabilności termicznej Pfu i 'proofreading' zdolności. W odróżnieniu od Taq DNA polimerazy, Pfu DNA polimeraza posiada również proofreading aktywność egzonukleazy w kierunku 3'->5', co skutkuje mniejszą ilością błędów fragmentów PCR niż Taq-generowane PCR fragmenty. Pfu DNA polimeraza jest skuteczna w technikach, które wymagają wysokiej wierności syntezy DNA, ale także może być stosowana w połączeniu z Taq polimerazą do uzyskania wierności Pfu oraz szybkości działania polimerazy Taq.

Zastosowanie:
- Wysokiej wierności PCR i reakcje wydłużania startera
- Generacja PCR produktów do klonowania i ekspresji 
- PCR klonowanie i generacja tępych końców amplifikacji

- RT-PCR dla cDNA klonowania i ekspresji
- Mutageneza ukierunkowana
- Klonowanie tępych końców PCR

Źródło:
Termostabilna DNA polimeraza z hipotermofilnej archaeon pyrococcus furiosus.

Definicja jednostki:
Jedną jednostkę enzymu definiuje się jako ilość enzymu, niezbędną do przeprowadzenia reakcji inkorporacji 10 nmoli deoksyrybonukleotydów dNTPs do frakcji zaabsorbowanej na nośniku stałym, w czasie 30 min w temperaturze 74 °C przy standardowych warunkach analizy polimerazy DNA .

Dostarczana wraz z buforem: 10x Pfu Reaction Buffer (z dNTPs)

10x Pfu bufor reakcyjny (z  dNTPs):  
200mM Tn3 pH 8.8
20 mM MgSO₄
100 mM KCl
100 mM (NH₄)₂SO₄
1% Triton
1 mg/ml BSA
2 mM dNTP

Polimeraza zawieszona jest w buforze o składzie:

20 mM Tris-HCl (pH 8.0)
40 mM NaCl
0.1 mM EDTA
1 mM DTT
50% (v/v) glicerol

Inaktywacja cieplna:
95% nieaktywna po 1-godzinnej inkubacji w 98°C

Zalecane warunki reakcji:
1X Pfu bufor, 200 µM każdy  dNTP, 0.1-0.5µM każdy primer, 5 U Pfu DNA enzymu polimerazy, 1-100ng plaplazmidowej matrycyDNA, lub 100-250ng genomowej matrycy DNA.

Zalecane warunki przechowywania: -20ºC