Aktualności

Archiwum aktualności
Strona główna>Produkty>Analiza kwasów nukleinowych>NGS sekwencjonowanie>Enzymy i zestawy do amplifikacji>I-5™ Hi-Fi HotStart DNA Polymerase
https://www.carolinabiosystems.cz/119-thickbox_default/i-5-hi-fi-hotstart-dna-polymerase.jpg View full size

I-5™ Hi-Fi HotStart DNA Polymerase

Kontakt z nami

I5HD-100

I-5 Hi-Fi DNA HotStart Polymerase to polimeraza DNA o wysokiej dokładności i szybkości działania, aktywowana termicznie (HotStart).

I-5 Hi-Fi DNA HotStart Polymerase jest polimerazą DNA o ultra-szybkim działaniu i wysokiej dokładności. Zapewnia wydajną amplifikację trudnych matryc, takich jak plazmidy, BACS, DNA genomowe i DNA lambda. Pozwala na amplifikację do 10 kb ludzkiego DNA genomowego i do 21 kb DNA lambda. Ma prędkość przedłużania wynoszącą 1 kb / 10-15 sekund, w zależności od rodzaju matrycy. Pozwala to użytkownikom zaoszczędzić czas, przyspieszając reakcje PCR, oraz zapewnia wyższą dokładność niż Taq czy Pfu. Enzym zawiera mechanizm HotStart, który dezaktywuje enzym do momentu podgrzania. Pozwala to na przygotowanie reakcji PCR w temperaturze pokojowej, eliminując obawy związane z dimery primerów lub nieswoistą preamplifikacją.

Cechy:

  • Szybka – 1 kb / 10-15 sekund
  • Wysoka dokładność – 1 błąd na 110 538 nt
  • Solidna – tolerancja na inhibitory
  • Wysokie wydajności – wysoka efektywność
  • PCR długiego zakresu – około 10 kb ludzkiego DNA genomowego

Źródło: E. coli

Zastosowania:

  • Hot Start PCR
  • Rutynowe PCR
  • Szybkie PCR
  • PCR wysokoprzepustowe
  • Genotypowanie

Dostarczony z:

  • 5X Buforem Reakcyjnym (1 ml, 5X MgCl2 dołączone)
  • 50 mM MgCl2 (1 ml) (do optymalizacji)

Dostarczony w (opis bufora): 20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 200 µg/ml BSA, 50% glicerolu, 1X stabilizator, pH 8.0 @ 25°C

Warunki przechowywania: -20ºC

Definicja Jednostki: Jednostka to ilość enzymu, która w ciągu 15 minut przy 72°C wbudowuje 5 nmol dNTP do nierozpuszczalnego w kwasie materiału.

Dane eksperymentalne:

Porównanie polimeraz DNA o wysokiej dokładności: I5 (MCLAB), KAPA (Roche) i Q5 (NEB)

Dokładność polimerazy DNA oceniana jest przez współczynnik błędów, tj. procent substytucji zasad na cykl PCR (przy efektywności replikacji 2.0). Współczynniki błędów polimerazy DNA I5 (MCLAB), KAPA (Roche) i Q5 (NEB) zostały zmierzone zarówno za pomocą sekwencjonowania Sangera, jak i sekwencjonowania nowej generacji (Illumina_MiSeq) (Tabela 1).

 

Polimeraza DNAI5KAPAQ5
Sekwencjonowanie Sangera (błąd /100,000bp) 0.9 1.7 0.9
NGS_Illumina (błąd /100,000bp) 1.6 1.3 2.5

 

Wnioski:

Dokładność polimerazy DNA I5 firmy MCLAB jest ultra-wysoka, z przeciętnie 1.25 błędu na 100,000 par zasad zarówno według sekwencjonowania Sangera, jak i NGS_Illumina, co jest przynajmniej równoważne dokładności KAPA lub Q5.

Metody:

W tym teście I5 zostało przebadane pod kątem swojej dokładności w porównaniu z polimerazami DNA KAPA i Q5. Matrycą o długości 2000 pb było amplifikowane PCR z użyciem I5, KAPA lub Q5 przez 35 cykli. Wskaźniki błędów PCR zostały ustalone za pomocą sekwencjonowania Sangera (Rysunek 1) i NGS_Illumina (Rysunek 2). Dane surowe zostały znormalizowane za pomocą równania:

e=n(f⋅2)

gdzie f to procent błędów zmierzonych po PCR, a n to liczba rzeczywistych cykli PCR.

 I5-001.png

Rysunek 1. Ocena dokładności polimerazy PCR za pomocą sekwencjonowania Sangera.

I5-002.png

Rysunek 2. Ocena dokładności polimerazy PCR za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (Illumina_MiSeq).

Referencje: Frey, B. and Suppman, B. (1995). BioChemica. 2, 34-35. Chester, N. and Marshak, D.R. (1993). Analytical Biochemistry. 209, 284-290.

Warunki wysyłki: suchy lód

 

Protokół


  25 µl Reaction 50 µl Reaction Final Concentration
       
Instructions      
       
  25 µl Reaction 50 µl Reaction Final Concentration
I-5 5X Buffer 5 ul 10 ul 1X (see notes)
10 µM Primer A 1 µl 2 µl 400 µM
10 µM Primer B 1 µl 2 µl 400 µM
Template DNA as needed as needed see notes
50mM MgCl2 as needed as needed see notes
I-5 Enzyme 0.5 - 1 ul 1 - 2 ul  
Water (ddH2O) up to 25 µl up to 50 µl  
       
       
Thermocycling Conditions      
       
3 Step PCR      
Step Temperature Time  
Initial Denaturation 98°C 2 minutes  
Denaturation 98°C 10 seconds 25-35 cycles
Annealing 55°C - 68°C 10-15 seconds  
Extension 72°C 10-15 seconds / kb  
Final Extension 72°C 1-5 minutes  
  4°C Hold  
       
2 Step PCR (see notes)      
Step Temperature Time  
Initial Denaturation 98°C 2 minutes  
Denaturation 98°C 10-15 seconds 25-35 cycles
Combined Annealing & Extension 72°C 15-30 seconds / kb  
Final Extension 72°C 1-5 minutes  
  4°C Hold  
       
Notes      
       
Recommended DNA Template addition      
Genomic DNA 50-250 ng    
Plasmid DNA 1pg-10ng    
Viral DNA 1pg-10ng    
       
Mg2+      
The final concentration of Mg2+ in 1X I-5 PCR Master Mix is 1.5 mM      
Add additional Mg2+ as needed in 0.5 mM increments      
Suggested final Mg2+ concentration ranges from 2 mM to 4 mM      
       
2 Step PCR      
Use 2 Step PCR is recommended when the primer Tm values are >68°C      
       
PCR Product / Cloning      
The 2X I-5 PCR Master Mix results in PCR product with blunt ends      
Blunt-end cloning is recommended after PCR with this product      
For T/A-cloning, the PCR product should be purified before A-addition      

 

Koszyk  

Brak produktów

0,- Kč Razem

Koszyk Realizuj zamówienie