RCA DNA Amplification Kit

Popis

RCA DNA amplifikační kit od společnosti MCLAB je nový produkt vyvinutý speciálně na přípravu templátů pro sekvenování DNA. Jak je znázorněno na obrázku 1, metoda RCA využívá bakteriofágovou phi29 DNA polymerázu k exponenciální amplifikaci jednovláknových či dvouvláknových kruhových DNA templátů pomocí metody RCA (rolling circle amplification). Pomocí této metody lze během několika hodin navýšit pikogramové množství výchozího materiálu na mikrogramová množství DNA. Díky tomu je eliminována potřeba buněčné kultivace přes noc a konvenční purifikace plasmidové nebo M13 DNA. Korekční aktivita phi29 DNA polymerázy zajišťuje vysoce věrnou replikaci DNA.

Výchozím materiálem pro amplifikaci může být malé množství bakteriálních buněk obsahujících plazmid, izolovaný plazmid, intaktní fág M13 nebo jakýkoli cirkulární vzorek DNA. Bakteriální kolonie odebrané z agarových destiček mohou být přidány přímo do RCA reakce. Alternativně mohou jako výchozí materiál sloužit mikrolitrové množství nasycené bakteriální kultury nebo zásobního glycerolu.

V závislosti na zdroji výchozího materiálu je amplifikace při 30 °C dokončena za 4–18 hodin. Produktem RCA reakce jsou dvouvláknové konkatemery (dlouhá lineární molekula s mnoha kopiemi amplifikované DNA) kruhového templátu s vysokou molekulovou hmotností. DNA amplifikovaná metodou RCA může být použita přímo v cyklických sekvenačních reakcích bez jakéhokoli čištění.

Obrázky:

Obrázek 1. Schematický diagram metody RCA. Náhodné hexamerní primery nasedají na kruhovou templátovou DNA na více místech. Phi29 DNA polymeráza prodlužuje každý z těchto primerů. Když DNA polymeráza dosáhne následujícího primeru, dochází v místě syntézy k uvolňování amplikonu. Uvolněný jednořetězcový řetězec může následně hybridizovat s primerem a vše se opakuje. To vede k exponenciálnímu isotermickému růstu počtu kopií DNA.


Obrázek 2.
 

Komponenty:

RCA DNA Amplification Kit (100 reakcí)
Cat #: PPK-100
Phi29 DNA Polymerase, 20 µl, (10,000 units/ml)
2x MCRCA mix, 1 ml
Cell Lysis Buffer, 1 ml

RCA DNA Amplification Kit (500 reakcí)
Cat #: PPK-200
Phi29 DNA Polymerase, 1 00µl, (10,000 units/ml)
2x MCRCA mix, 5 ml
Cell Lysis Buffer, 5 ml