QuantumScript™ Reverse Transcriptase

Opis:

QuantumScript™ Reverse Transcriptase to nowa zmutowana wersja odwrotnej transkryptazy M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) o minimalnej aktywności RNazy H i zwiększonej termostabilności. Enzym jest oczyszczany do jednorodności, co zapewnia wysoką wydajność. Optymalna temperatura syntezy pierwszego łańcucha cDNA dla tego enzymu wynosi 42°C, a rozmiar produktu cDNA mieści się w zakresie od 100 pb do 7 Kb.

Numer katalogowy: SSII-100, SSII-200 i SSII-300

Źródło: E. coli

Stężenie: 200 jednostek/μl

Bufor przechowywania: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM DTT, 0.05% Triton X-100 (v/v), 0.1 mM EDTA, 0.1 M NaCl i 50% glicerolu (v/v)

Bufor reakcji (5x): 250 mM Tris-HCl (pH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2 i 50 mM DTT

Definicja jednostki: Jedna jednostka enzymu wbudowuje 1 nmol dTTP w materiał kwasowy w 10 minut przy 37˚C, używając poli(A): oligo(dT)25 jako matrycy-i startera.

Kontrola jakości: Ten enzym przeszedł testy kontroli jakości: analiza SDS-PAGE w zakresie czystości, funkcjonalna absencja aktywności endonukleazy/nikazy, funkcjonalna absencja aktywności egzonukleazy, funkcjonalna absencja aktywności proteazy.

Przechowywanie i obsługa: -20˚C

Protokół

Synteza pierwszego łańcucha cDNA Materiały dostarczane przez użytkownika:

Inhibitor RNAzy (Cat.# RNIN-100, RNIN-200, RNIN-300) dNTP, 10 mM (Cat.# dNTP-10M, dNTP-25M) Woda nukleazowa Poniższa procedura używa 10 pg do 5 µg całkowitego RNA lub 10 pg do 500 ng mRNA.

W sterylnym mikrocentryfugowym probówce RNazowej dodaj startery (200-500 ng oligo(dT)12-18, 50-250 ng startera losowego lub 2 pmol starterów specyficznych). Podgrzej probówkę do 70°C przez 5 minut, a następnie inkubuj na lodzie przez 1 minutę, aby denaturować ewentualne struktury wtórne w obrębie matrycy. Krótko obróć, aby zbierać roztwór na dnie probówki. Dodaj do scharakteryzowanego startera/matrycy w kolejności pokazanej poniżej. Uwaga: Nie zmieniaj proporcji startera do mRNA. 5 µl 5X buforu reakcji; 5 µl 10mM mieszanki dNTP (10mM każdego dATP, dGTP, dCTP i dTTP) 25 jednostek inhibitora RNAzy 0,5 µl QuantumScript Reverse Transcriptase (100 u/μl) Dodaj wodę nukleazową do objętości końcowej 25 µl Delikatnie wymieszaj. Dla starterów losowych inkubuj probówkę w 25°C przez 5 minut. Przeprowadź syntezę pierwszego łańcucha przy 42°C przez 30-60 minut. Temperatura reakcji może być zoptymalizowana między 50°C a 60°C dla trudnych matryc o wysokiej strukturze wtórnej. Zdezaktywuj enzym, inkubując go w 70°C przez 15 minut po reakcji. Przed wykonaniem amplifikacji PCR po kroku 4, zaleca się usunięcie RNA przed amplifikacją PCR, aby zapewnić uzyskanie produktu PCR. Dodanie 2 jednostek RNazy H (Cat. # RNHE-100, RNHE-200, RNHE-300) i inkubacja przez 20 minut w 37°C jest zalecane do usunięcia RNA. Standardowe protokoły dla syntezy drugiego łańcucha można znaleźć w literaturze [2]. Uwaga: 5X bufor reakcji jest kompatybilny z enzymami używanymi w licznych technikach analizy DNA. Typowo nie ma potrzeby ekstrakcji fenolowej ani osadzania etanolu z użyciem tego protokołu przed jakąkolwiek amplifikacją PCR.

Referencje:

Roth, M.J., Tanese, N. and Goff, S.P. (1985) Purification and characterization of murine retroviral reverse transcriptase expressed in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 260, 9326–35. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) In: Molecular Cloning: A; Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 8.64.